首頁 >> 新聞動態 >> 科研動態

科研動態

高彩霞和張正斌組聯合在植物雙功能基因組編輯系統建立取得新進展

發表日期:2020-07-03來源:放大 縮小

  sgRNA長度調控編輯類型的植物雙功能基因組編輯系統的建立是一個新的研究熱點和難點。近日,中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究員、張華偉副研究員和農業資源研究中心張正斌研究員合作,在SCIENCE CHINA Life Sciences(《中國科學:生命科學》英文版)在線發表了題為“Shortening the sgRNA-DNA interface enables SpCas9 and eSpCas9(1.1) to nick the target DNA strand”的論文。  

        該論文首次通過實驗證明了縮短spacer長度能夠使SpCas9eSpCas(1.1)表現出類似于nCas9(D10A)的切口酶活性,從機制方面解釋了改變spacer的長度導致SpCas9eSpCas9(1.1)核酸酶活性降低的原因。基于此發現,作者開發了由胞嘧啶脫氨酶(APOBE3A)eSpCas9(1.1)與尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)融合而成的植物雙功能基因組編輯系統。通常情況下,當spacer長度為20 nt時,雙功能基因組編輯系統APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI能在靶位點處產生Indels (insertion/deletion)突變;當spacer長度為19 nt時,APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI表現出胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的堿基編輯活性。因此,該系統可同時對多個靶位點分別實施不同類型的編輯,為基因功能研究和分子設計育種提供了新的工具。     

  來源于釀膿鏈球菌的SpCas9是研究最早應用最為廣泛的CRISPR/Cas9系統。已有的研究表明縮短或者增加spacer的長度可以提高SpCas9的特異性,同時研究發現改變spacer的長度也會影響SpCas9及其大部分變體的核酸酶活性,但是其作用機制并不清楚。該文通過實驗證明縮短spacer的長度會使SpCas9eSpCas9(1.1)表現出類似于nCas9(D10A)的切口酶活性。 

             

  基于此機制,作者開發了由胞嘧啶脫氨酶(APOBE3A)eSpCas9(1.1))與尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)融合而成的植物雙功能基因組編輯系統。通過在水稻原生質中對9個內源基因位點進行測試,發現在大多數位點,當spacer長度為20 nt時,雙功能基因組編輯系統APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI主要造成indels突變;當spacer長度為19 nt時,該系統主要行使胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)的堿基替換的功能。 

             

  小麥乙酰乳酸合成酶基因 TaALS-P174位點的胞嘧啶替換為胸腺嘧啶可以使小麥產生對除草劑煙嘧磺隆的抗性。此突變作為小麥遺傳轉化及組織培養過程中的篩選標記,可以提高突變體篩選效率。為了高效獲得TaGW2基因的敲除突變體,作者構建了分別靶向小麥TaALSTaGW2基因的spacer長度為19 nt20 nt的雙sgRNAs表達載體,與APOBE3A-eSpCas9(1.1)-UGI載體共同轉化小麥未成熟胚。在植物組織培養的過程中添加0.254 mg/L的煙嘧磺隆進行篩選,獲得了8棵小麥再生植株,經檢測這8棵植株中TaALSTaGW2基因共編輯效率達到100% 

            

  作物傳統的雜交育種過程中,由于基因連鎖導致一些優異等位變異難以聚合。植物雙功能基因組編輯系統可以克服基因連鎖的限制,快速的實現多種優良等位基因的聚合,加速作物基因功能研究和分子設計育種的進程。     

  該研究工作得到中國科學院戰略性先導專項、國家重大科技專項、國家自然科學基金委的等項目資助。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究員、張華偉副研究員以及農業資源研究中心張正斌研究員為共同通訊作者。農業資源研究中心博士生范榮和中國科學院遺傳與發育生物學研究所直博生柴壯壯為共同第一作者。 

  論文鏈接:https://doi.org/10.1007/s11427-020-1722-0 

    

附件:
彩88app